发布日期：2026-06-08 16:32    点击次数：181

半导体工程师 2025年05月21日 09:11 北京开yun体育网

冷冻电镜样品制备质料对最终实验末端至关遑急。本文详备先容了从载网聘任到数据汇集的完整责任历程，强调载网的质料评估、正确处理和存储对驻扎混浊和损坏的遑急性。叙述了名义处理时期（如等离子体处理）对优化卵白质样品在玻璃态冰中散布的影响，以及全金载网、石墨烯等材料若何权贵提升样品结实性和减少电子束发射下的样品迁徙。精准抵制的样品玻璃化过程和优化的成像参数是获取高分辨率结构数据的基础。

L.A. Passmore, C.J. Russo, Specimen Preparation for High-Resolution Cryo-EM, Methods in Enzymology,2016

1. 载网的聘任、处理与储存

载网质料评估与聘任

在冷冻电镜样品制备过程中，载网的质料径直影响最终的实验末端与数据可靠性。这些微米级的精密载网极易受到物理毁伤或环境混浊，因此必须严慎处理。在实验出手前，应使用光镜对载网进行全面检查，实时淘汰存在较着劣势、大面积蹂躏或混浊的载网。

尽管这一预检门径看似繁琐，但与后续样品制备和成像过程所破费的时辰比拟，这一插手不足为患，却能权贵提升实验的顺利率和数据质料。

就载网类型而言，市集上既有不功令陈列（如蕾丝状或多孔碳）的载网，也有具有功令孔洞阵列的产物（如Quantifoil、UltrAuFoil、C-flat等）。后者因其结构的高度规整性，不仅提供了更好的实验重迭性，还能简化数据汇集有缠绵，因此在高精度商酌中更受好奇。

在材料聘任方面，针对不同的应用场景，咱们（L.A. Passmore, C.J. Russo）有如下淡漠：负染色时期可选用铜基底上的无定形碳（am-C）载网，这类产物盛大易得且价钱适中；而冷冻电镜应用则保举使用全金载网，因其能灵验减少样品在电子束照耀下的迁徙，权贵提升成像质料。全金载网不错按照Russo和Passmore（2016）刻画的有缠绵自行制备，或径直从Quantifoil等供应商处购买买卖化产物（如UltrAuFoil®）。

载网的正确处理有缠绵

载网的处理时期看似浅近，实则需要精致操作。要害原则是恒久保持载网平整，幸免任何可能导致薄膜损坏的弯折。在操作过程中，应当使用敏锐的精密镊子，仅从载网的边际进行夹持和迁徙（图3）。咱们迥殊保举使用常闭构型的镊子（如Dumont N5型），这类镊子能在处理过程中对载网施加明确且可控的力度，减少东说念主为操作相反导致的载网毁伤。

图3 镊子对样品载网的损坏。障碍的镊子（A）或不妥使用（B）会导致样品载网损坏。为取得最好效果，应使用尖锐、平直的镊子（C），而且仅从边际处夹取载网（D）。对于A和C面板，比例尺为1毫米。对于B和D面板，比例尺为100微米。

在处理过程中，静电放电是另一个常被忽视却能形成严重损害的因素。提醒腕部接地带是一种浅近灵验的防静电法子（图4）。值得隆重的是，咱们不淡漠在操作镊子的手上提醒手套，尽管这在某些实验环境中是尺度作念法，但在载网处理中，手套不仅会导致镊子和载网上累积静电，还会诽谤操作的明智度和精准性。

图4 存放载网以幸免混浊和静电。A面板展示了载网处理中的不良作念法：使用手套和塑料存储盒会导致静电累积。图中，带电的载网正立在边际上。B面板展示了保举的处理规范，包括使用玻璃容器，拿镊子的手不戴手套，以及提醒腕部接地带以驻扎静电累积。

载网的储存环境与条款

经过清洁或修饰的载网应当妥善储存，以保管其名义性质和结构完整性。最好的储存容器是玻璃培养皿，而非塑料成品，因为后者可能开释有机残留物，混浊载网名义。储存环境应为干净、无油脂的干燥盒，确保环境中无尘埃颗粒。这种严格的储存条款对于保管载网的高质料状况和实验的可重迭性至关遑急。

为驻扎样品交叉混浊并扼杀环境混浊物，总共用于载网处理的器具、玻璃载片和容器都应如期进行澈底清洁。玻璃成品可通过在高纯度洗涤剂溶液（如2%的Micro-90）中进行超声波处理，随后用超纯18 MΩ去离子水充分冲洗的表情进行清洁。镊子在日常使用后，可采取酒精（酒精或异丙醇）超声波清洗；如发现存塑料或油脂残留物的混浊，则需使用更强效的溶剂，如氯仿和丙酮进行处理。

迥殊需要强调的是，用于载网冷冻的镊子应在每次处理不雷同品后进行澈底的酒精超声波清洗，以扼杀潜在的混浊。施行标明，通过镊子从一个载网到另一个载网的交叉混浊长短常盛大的现象，这种微量混浊虽难以察觉，却可能对实验末端产生权贵影响。在高精度结构分析中，这种看似轻捷的细节不时是确保数据可靠性的关节因素。

2.载网的混浊抵制与清洁时期

即使在最优化的储存条款下，载网在使用前仍可能需要非常的清洁处理。混浊起首多种千般，主要包括以下几类：

颗粒物资混浊：包括挥发的碳片、制造过程中的残留颗粒或储存过程中累积的环境灰尘。这些颗粒物资如不足时断根，会在加入水性卵白质溶液时再行悬浮，并最终在玻璃态冰中形成可见的杂质，过问后续的数据处理与分析。

有机残留物混浊：主要起首于处理或储存过程中千里积在名义的有机物资，以及制造过程中使用的光刻胶或其他高分子材料及溶剂残留。这类混浊物会权贵影响载网的润湿性和其他物理化学特色，诽谤实验的可重迭性和末端的一致性。

以下提供一种通过水和溶剂系统清洗来净化载网的有缠绵。需要迥殊隆重的是，清洁过程中应使用超高纯度（CMOS级）溶剂，以幸免引入新的混浊物。咱们不保举采取加热法清洁载网，因为高温可能蹂躏载网的结构完整性，导致薄膜变形或断裂。

安全告诫：本有缠绵触及使用高电压、高温、液态氮、易燃化学品/气体，以及在真空条款下操作真实立。这些操作应由训导丰富的科学东说念主员实行，且操作家应已完成总共联系的安全培训并进行了风险评估。请务必提醒安全眼镜和相宜的防护装备，并自行承担操气派险。

有缠绵1.（载网清洁规范）

1.用高纯度去离子水（18 MΩ，经过滤与UV处理）填充干净的玻璃结晶皿（保举使用Pyrex材质，直径90毫米，高50毫米）。水应添加至稍微溢出容器边际，以冲突名义的弯液面，灵验去除水名义上可能存在的任何混浊层（图5C）。

图5 去除样品载网上的名义混浊。载网不错循序用（A）氯仿、丙酮和异丙醇清洗。必须隆重幸免水（或溶剂）名义的混浊物千里积到载网上。B面板展示了一个暗意图。如C面板所示，容器装得过满不错减少名义混浊。比例尺为20毫米。

2. 准备三种溶剂洗涤液，折柳置于干净的小玻璃试管中（图5A）：

试管一：1毫升氯仿（淡漠使用Sigma 650498或同等纯度产物）

试管二：1毫升丙酮（Sigma 40289或同等品）

试管三：1毫升异丙醇（Sigma 40301或同等品）

溶剂操作应使用玻璃巴斯德吸管，因为多数有机溶剂会熔解塑料成品，可能导致塑料残留物再行千里积于载网名义。

3. 使用干净的精密镊子（Dumont N5或5型）防御夹取单个载网，将其沉稳浸入晶体皿一侧的水中。此时，载网名义的松散混浊物可能会飞动至水面。为幸免这些飞动混浊物再行千里积到载网上，应将载网横向穿过水，从晶体皿的另一侧取出。在穿水过程中，确保载网的薄边际朝前，以减少对穿孔薄膜的毁感冒险。取出后，将载网边际轻轻斗争滤纸（Whatman No. 1型）以去除过剩水分，但务必隆重不要使载网发生弯折。如使用非防毛细管镊子，应在镊子尖之间进行吸干操作。

4.循序将载网浸入前述准备的三种溶剂中，每种溶剂浸泡10-20秒。临了一步的异丙醇漂洗尤为关节，应使用最纯洁的溶剂，因为此阶段的任何残留物都将径直千里积在载网名义。如使用非防毛细管镊子，每次漂洗后应在镊子尖之间吸干过剩溶剂。

5.将载网边际轻触滤纸，去除残留的异丙醇。

6.将载网放手在干净玻璃培养皿（淡漠使用Schott，70毫米型号）中的滤纸（Whatman No. 1，70毫米圆形）上，薄膜面进取，自然晾干。培养皿应盖上玻璃盖，减少环境灰尘的千里积。

7.皆备干燥后，载网应存放在有盖的玻璃培养皿中，但最好施行是在清洁后尽快使用，以确保名义特色的结实性。

3. 非晶碳和石墨烯连气儿薄膜的制备与应用

非晶碳或石墨烯的连气儿薄膜为卵白质样品提供了一种与基底相互作用的替代名义。在特定情况下，这类薄膜不错权贵改善卵白质在玻璃态冰中的散布状况或分子取向。此外，由于颗粒不错在吸走过剩液体前吸附到薄膜名义，因此偶然不错使用较低浓度的卵白质溶液，这不仅精真金不怕火了厚爱的样品，还能优化成像条款。

以下提供一种制备薄层（2-5nm）非晶碳薄膜的详备有缠绵，该薄膜可行为颗粒吸附的理思名义。雷同的有缠绵也适用于制备较厚（5-10 nm）的碳薄膜，可转机至无穿孔薄膜的裸载网上用于负染色时期。

有缠绵2.（非晶碳千里积规范）

本有缠绵基于使用配备水冷式Inficon晶体厚度监测器的Edwards 306 Turbo镀膜系统将碳千里积到云母片上的历程，但可把柄实验室现存确立进行相宜调治。

1 掀开系统透风口，移除防爆罩和玻璃钟罩。

2 操作前戴上无粉末混浊的干净手套，并在处理腔内总共组件时保持手套提醒状况。

3 取下碳源安装，移除屏蔽罩，在夹头中安装一根新的尖锐碳棒（应选用高纯度石墨，杂质含量<5 ppm），并保持相宜的机械张力。

4 使用压缩氮气澈底吹除任何碳屑或碎屑，这些轻捷颗粒可能导致电极间短路，影响千里积质料。

5 将碳源安装再行放手于真空腔内，调治碳棒位置使其距离样品台约125毫米。固定时仅需用手指拧紧螺母，无需使用扳手，以幸免过度应力。

6 云母行为一种多层矿物晶体，具有极其平整的名义特色（每宽泛毫米均方根粗鄙度小于1纳米），且易于获取大面积样品，因此被无为用作碳千里积的模板基底。取一派云母（如Agar G250-1型号），用刀片将其一分为二，将两片云母片放手于样品台上，劈裂面进取，径直位于碳源正下方，并放在新的滤纸（Whatman No. 1）上。云母应在涂覆前立即崭新劈开，因为新劈开的名义具有理思的清洁度和亲水性，而在空气中永劫辰清晰后会被环境混浊物隐秘，导致名义疏水化。

7 可使用一枚干净的金属硬币或近似小金属片在真空抽气过程中固定云母片和滤纸，驻扎移位。

8 检查挡板在开启和关闭状况下的位置：关闭时应皆备隐秘从碳源到云母和晶体厚度监测器的立体角；开启状况下，通向云母和晶体的旅途应无缺乏且旅途长度格外。开动状况应保持在关闭位置。

9 仔细检查钟罩垫圈和底板是否存在灰尘、污垢或碳、金属碎屑。如有必要，使用无绒纸和高纯甲醇进行澈底清洁。

10 再行安装玻璃钟罩和防爆罩。

11 填充液氮冷阱至相宜液位。

12 按下抵制面板上的轮回按钮启动真空抽气过程。

13 当门阀掀开时，系统压力应马上降至10^-5托边界。此时不错通过掀开低压电源（LT）并沉稳增多电流至约1.0安培，出手预热碳源安装。

14 恭候10分钟后，将电流沉稳增多到1.2安培。

15 再恭候5分钟，将电流增多到1.4安培。

16 在1.4安培保管20分钟，随后关闭电源。此时应补充液氮至冷阱。

17掀开晶体厚度监测器的冷却水系统，并阐明已聘任正确的碳规范参数。将厚度炫耀归零。

18 系统真空度应在约一小时内降至10^-7托边界，这是进行高质料碳千里积的必要条款。

19 一朝真空度达到<5×10^-7托，在约5分钟内沉稳将电流再次增多到1.6-1.7安培，隆重抵制增多速率以幸免电弧放电。在碳源加热过程中，系统压力不应升高至>5×10^-6托。

20 当碳出手千里积时，电流引导将出现幽微波动。此时掀开挡板进行10-20秒的千里积，随后关闭挡板并稍微诽谤电流。

21 晶体监测器在开动阶段可能会由于热效应炫耀负值，但在关闭挡板后，炫耀值将规复至一个正数，这代表了累积的碳膜厚度。可重迭上述过程直至达到所需厚度。

22 完成千里积操作后，关闭挡板并皆备关闭碳源电源。

23 在透风掀开系统前，应让真空腔冷却至少30分钟，以确保千里积碳膜的结实性。

24 使用干燥氮气沉稳透风，取出涂覆的云母片并存放在洁净的玻璃培养皿中。

25 再行安装钟罩和防爆罩，按下轮回按钮启动抽真空，待真空度达到200毫托后，按下密封按钮完成系统密封。

遑急隆重事项

晶体厚度监测器应按照制造商的说明，使用寂寥的厚度测量有缠绵如期校准。在咱们往日的商酌中，曾使用原子力显微镜进行此类校准（Russo & Passmore, 2014a）。碳密度可能因源材料质料而略有相反，但时常应约为2.2 g/cm³。从启动到完成，总共这个词千里积过程不应越过4小时。除非使用皆备干燥（无油）的抽气系统，不然不淡漠过夜抽气，因为当液氮阱温度回升时，泵油可能回流至腔体，形成系统和云母样品的油混浊。咱们在之前的商酌中提供了一个将非晶碳转机到千般载网上的详备有缠绵（Russo & Passmore, 2016），该有缠绵在Quantifoil和全金载网上均阐述出色。这一滑移有缠绵在有缠绵3中有详备刻画，可行为制备高质料碳薄膜载网的遑急补充工艺。

有缠绵3：无定形碳向载网的转机

实验操作过程中，静电放电可能对载网形成不行逆毁伤，因此必须采取相宜防护法子。同期，载网的质料抵制亦然实验顺利的基础。具体操作门径如下：

1提醒腕部接地带，驻扎在操作过程中产生静电而损坏载网。使用镊子时，操作家不应提醒手套，或确保镊子径直接地，以扼杀静电累积的可能性。

2 在电镜下仔细检查载网，剔除任何存在劣势的部分。及格的载网应当名义平整、结构连气儿，且无灰尘或纤维状杂质附着。

3 若发现载网名义存在光刻处理残留的塑料物资，可依照有缠绵1进行澈底清洁处理。

4 为驻扎指纹和外源混浊，提醒手套将滤纸（Whatman No. 1，直径70毫米）置于不锈钢网圆片（直径65毫米，由0.7毫米线制成，载网为3毫米）上。该网片应放手在玻璃结晶皿（Pyrex材质，直径90毫米，高度50毫米）中的不锈钢环（经抛光和倒角处理的边际，厚度2毫米，高度10毫米，直径50毫米）内（参见图6）(Russo & Passmore, 2016)。

图6 在载网上千里积无定形碳薄膜的安装。A面板炫耀了浮动室的横截面图。跟着水位的诽谤，无定形碳的薄膜被千里积到载网上。不锈钢环形成一个正弯月面，匡助将碳膜向环的中心诽谤。B面板炫耀了该安装使用中的相片。doi: 10.1016/j.jsb.2015.11.006。

5 用高纯度去离子水（18 MΩ，经过滤和UV处理）填充结晶皿。注水至溢出状况以蹂躏名义张力形成的弯月面，并去除水名义的任何潜在混浊层（参见图5C）。随后倾倒过剩水分，使水位适值低于玻璃皿边际。

6 使用经溶剂冲洗清洁的镊子（Dumont N5或5型号），严慎地将载网放手在滤纸中央，箔面进取。载网应垂直于水面沉稳浸入，以幸免气泡形成和载网损坏。

7 诞生虹吸系统：将管说念（长0.6米，外径3.2毫米，内径1.6毫米）流畅至配有常闭镊子或弹簧夹的网罗容器。通过打针器启动虹吸流动，并在碳膜飞动过程中（下一门径）暂时夹住管说念抵制流速。

8 通过以20-30°角沉稳将一派约2.5×2.5厘米的无定形碳涂覆云母片（碳面进取）浸入水中，使碳膜从云母基底飞动分离。可采取掠角光源照耀水面，增强对飞动碳膜的可视化不雅察效果。

9 借助虹吸系统缓缓诽谤水位，抵制碳膜的下落速率。

10 密切监控碳膜相对于载网的位置，必要时用清洁的镊子轻推调治，确保碳膜恒久保持在载网中央位置。

11 当碳膜皆备千里积于载网名义且水位降至低于滤纸时，防御取出不锈钢环。随后取出滤纸与网片举座，置于干燥滤纸上，并用洁净的玻璃培养皿或烧杯隐秘，隐秘物应稍微歪斜以留出水分挥发空间。令其在室温下自然干燥数小时。

12皆备干燥后，将制备好的样品置于洁净的玻璃培养皿中保存，直至使用前。

石墨烯行为新式二维材料，因其细见地晶格结构和超卓的导电性能，在多方面优于传统的无定形碳。尤为遑急的是，在冷冻电镜热心的分辨率边界内，石墨烯内容上简直不行见，而无定形碳则会引入非常的配景噪声，这对于商酌较小卵白质结构迥殊不利。以下内容详备先容将石墨烯转机到Quantifoil载网上的精准规范（参见图7，有缠绵4）(Regan et al., 2010)。

此转机过程需使用超高纯度（CMOS级）溶剂和酸性试剂以确保转机的可靠性并幸免混浊。总共这个词操作过程中，操作家应恒久提醒腕部接地带，驻扎静电放电损害载网，因石墨烯薄膜对静电迥殊敏锐。总共玻璃器皿在使用前必须经过澈底清洁。值得隆重的是，全金属载网的新式转机有缠绵正在研发中，将来石墨烯全金载网有望罢了买卖化供应。

有缠绵4：石墨烯向载网的转机

1 仔细检查新清洁的载网（Quantifoil Au 300 1.2/1.3，参照有缠绵1的清洁有缠绵），剔除任何存在劣势的载网。

2 石墨烯时常通过化学气相千里积(CVD)有缠绵滋长在薄铜基底上，可从专科买卖供应商（如Graphene Supermarket，Structure Probe Inc.等）购买。从已阐明存在石墨烯的铜/石墨烯源材料上冲压出3.2毫米的圆盘（图7B，C）。本实验室采取定制的机械冲头，此类器具亦可从Structure Probe, Inc.获取。

图7 石墨烯转机到带有碳膜的相沿物上。该过程在A面板中以图表风物展示。B和C面板炫耀在空气中加热至150°C赓续10分钟的铜，其中B皆备隐秘着石墨烯因此不会氧化，而C莫得石墨烯隐秘因此由于氧化而变色，比例尺为3毫米。这种浅近的测试用于艳丽箔片上石墨烯的位置。D和E面板炫耀载网-石墨烯-铜三明治结构，比例尺折柳为1毫米和10微米。F面板展示了在蚀刻剂中飞动的三明治结构，其中不错看到部分被蚀刻的铜晶粒（比例尺1毫米）。G面板是带有冰的悬浮石墨烯的电子衍射图案，箭头指向来自石墨烯晶格的2.1埃反射。

3 将经检查的载网置于每个圆盘上，箔面朝下。

4 将拼装好的结构夹在两片洁净玻璃片之间加压，随后移除顶部玻璃片。

5 使用洁净移液管，在载网-石墨烯-铜三明治结构顶部精准加入7微升异丙醇（Sigma 40301）并待其自然干燥。

6 在高分辨率光镜下仔细检查，阐明碳箔是否与铜名义充分附着。顺利附着的区域会呈现较着的神色变化（图7E），只好附着精采的区域才气在后续门径中顺利转机。

7 在透风橱内有序摆放并象征七个硼硅酸盐玻璃结晶皿（直径70毫米）。

8 在第一个结晶皿中注入约2/3容量的含缓冲FeCl3的铜蚀刻剂（Sigma 667528）。

从玻璃片轻轻滑动，将载网圆盘三明治结构防御放手在FeCl3液面上。使用硼硅酸盐玻璃培养皿盖（直径80毫米）隐秘，驻扎蚀刻过程中灰尘侵入。

9 在FeCl3溶液中进行蚀刻约20分钟（适用于25微米厚的铜基底）。

10 折柳在三个结晶皿中注入约2/3容量的20% HCl（Sigma 40233）、20% HCl和2% HCl溶液。

11 愚弄经火焰处理的铂环（平允或EMS 70944）将载网一一滑移至各溶液皿中。每个门径中让样品飞动10分钟，完成充分清洗。

12用最高纯度的去离子水填充另外三个结晶皿，行为最终清洗门径。

13 连接使用铂环转机时期，在每个水浴中冲洗样品3-5分钟。

14 临了一次使用铂环转机并翻转样品，使石墨烯面进取，放手在滤纸上（Whatman No. 1，70毫米圆片）。将其置于洁净的硼硅酸盐玻璃培养皿（70毫米）中自然干燥。

15 将实验产生的酸性废液按照实验室章程的危境废料处理历程相宜处治。

16 历久保存时，应将样品置于无任何油类或碳氢化合物的干燥环境的玻璃容器中。切勿使用任何类型的塑料容器存储，以幸免潜在混浊。

4 载网名义处理时期

载网名义时常呈疏水性，这会窒碍水溶液在其名义的灵验铺展，影响样品制备质料。为精准抵制名义亲水性，可采取粗劣等离子体处理时期（图8）。此过程中，从低压气体产生的离子息争放基与名义发生相互作用，一方面去除残留有机混浊物，同期与名义进行化学响应以诽谤其疏水性。

图8 辉光放电产生的等离子体。图中展示了三种不同仪器产生的残留空气等离子体。这些仪器都能灵验增多相沿名义的亲水性，但具有不同进程的可重迭性，并可能损坏相沿物。需要隆重的是，辉光放电安装中的等离子体时常是不均匀的，这可能导致清晰剂量权贵变化，即使在合并批次中亦然如斯。比例尺为20毫米。

自然不错使用剩余空气产生的等离子体（即辉光放电时期，见有缠绵5），但为追求更高的实验重迭性，咱们保举使用要素可控的等离子体系统（有缠绵8）。等离子体处理时常采取氩气:氧气搀杂物，某些情况下也可使用氢气（有缠绵7）。此外，还可引入戊胺等功能性分子来修饰名义特色，改造待分析颗粒在名义上的取向散布（有缠绵6）(da Fonseca & Morris, 2015）。

有缠绵5：载网的辉光放电处理

1 在电镜下仔细检查已清洁的载网，剔除任何有劣势的样品。总共载网应确保平整、连气儿，且无灰尘或纤维状杂质。

2 将及格的载网放入辉光放电安装（如Edwards S150B）的真空腔室内，置于洁净玻璃片上，箔面进取，位于台面中央位置。处理放入腔室的任何物品时必须提醒手套，驻扎混浊。

3将腔室抽真空至200毫托压力。

4 开启高压电源至7千伏，电流应结委果28-30毫安边界内。

5 对载网进行精准30秒的处理。

6 处理完成后关闭高压电源，沉稳透风腔室规复大气压。

7 将处理过的载网置于洁净玻璃培养皿中保存，并应在1小时内使用，以取得最好效果。

在最近的一篇Nature文件中，商酌答复了去甲肾上腺素转运卵白(NET)的冷冻电镜结构，包括游离态、底物投合态以及与六种抗抑郁药投合的复合物风物。

把柄文件内容，在冷冻电样品制备过程中，商酌东说念主员将2.3μl纯化的NET卵白(浓度为1.2mg/ml)应用到经过辉光放电处理(Coolglow, SuPro Instruments)的多孔碳载网上(Quantifoil R1.2/1.3 Au 300 mesh)。

辉光放电处理后(Coolglow, SuPro Instruments)的多孔碳载网放大图，提升碳载网名义的亲水性，使卵白质溶液简略更均匀地散布在网格名义，匡助形成更薄、更均匀的冰层，改善样品的分散性，驻扎卵白质分子鸠集匡助形成更薄、更均匀的冰层。

去甲肾上腺素转运卵白(NET)的冷冻电镜图片

在辉光放电处理后，过剩的液体被Vitrobot Mark IV确立去除，然后载网被马上冷冻在液态乙烷中，以保持卵白质的自然状况用于随后的冷冻电镜不雅察和结构分析。

有缠绵6：载网的戊胺等离子体处理

1在电镜下仔细检查载网，剔除任何存在劣势的样品。总共载网应确保平整、连气儿，且无灰尘或纤维状杂质。

2 将及格的载网放手在腔室内的洁净玻璃片上，箔面进取，准细目位于电极环的中心位置（图8）。

3在腔室台面边际放手一个装有0.5毫升戊胺的袖珍玻璃瓶。

4用钟罩隐秘总共这个词系统，将腔室抽真空至低于400毫托压力。

5 启动高压电源，调治功率参数直至形成均匀结实的等离子体（在咱们使用的系统中，时常约为90伏，1.5安）。

6对载网进行30-60秒的精准处理。

7处理完成后关闭高压电源，沉稳透风腔室规复大气压。将使用过的戊胺瓶按影相宜的废料处理历程处治。

8将处理过的载网存放在洁净的玻璃培养皿中，并应在1小时内使用，以确保名义修饰效果。

有缠绵7：氩氧等离子体处理

1在电镜下仔细检查载网，剔除任何存在劣势的样品。总共载网应确保平整、连气儿，且无灰尘或纤维状杂质。

2咱们使用配备自界说吊挂载网的Fischione 1070等离子体腔，该载网最多可同期容纳10个载网（图9）。在此设立中，载网与射频线圈的距离保持在约15±1厘米。为提升批次间曝光的重迭性，淡漠恒久将载网相对于等离子体源保持在研究的空间位置。或者，也不错将样品径直放在腔室内的洁净玻璃片上，箔面进取，置于腔室的载网上。

需隆重的是，未经精采屏蔽或能量过高的等离子体可能和会过溅射效应损坏金属载网；应尽量幸免这种情况发生。每批次最多可处理20个载网。操作过程中应恒久提醒手套处理总共进入真空腔的物品，驻扎混浊和指纹残留。

图9 用于名义改性的特定等离子体的产生。(A和B) Fischione Model 1070和Gatan Solarus产生具有特定要素的等离子体。(C) MRC LMB制造的定制样品台的相片（上）和暗意图（下）。图中炫耀了两种不同的夹具瞎想——一种用于清晰相沿物的一侧，另一种用于清晰两侧。盖子用于驻扎载网在处理过程中迁徙。(D) 等离子体产生的暗意图。

3将腔室抽真空终点高真空度（≪10^-4托）。

4 精准抵制通入高纯度氩气和氧气（BOC 99.9999%）的比例为9:1，保管压力在21毫托（相等于31.0 SCCM气体流量）。

5 施加射频等离子体，正向功率抵制在38瓦，反向功率保持在2瓦（Fischione 1070确立上的70%功率诞生），赓续时辰为10-60秒（对大多数载网而言，20-30秒为最公意义时辰）。可把柄内容需求优化处理时辰以取得相宜的亲水性（影响水溶液的铺展性和冰的厚度）。

对于含碳的非晶载网，淡漠通过进行几次沉稳增多剂量的等离子体处理，并细目已知厚度的碳层皆备被蚀刻所需的时辰，从而训导性地校准碳蚀刻率。

6 对于迥殊薄的连气儿碳膜，应采取19:1的氩:氧比例和诽谤的功率（35瓦正向功率），裁汰处理时辰至5-15秒，以幸免过度蚀刻。

7处理完成后排气等离子体腔，取出载网并应在1小时内使用，以取得最好名义亲水性效果。

使用粗劣量氢等离子体时期，不仅不错灵验去革职义混浊物，还能精准抵制卵白质在石墨烯名义的吸附行动。以下胪陈使用Fischione 1070等离子体系统和Dominik Hunter型号20H-MD氢气发生器（径直流畅到等离子体发生器的输入端口）进行氢等离子体处理的尺度化历程。

值得强调的是，自然氢等离子体处理时期具有精采的结实性，但为最大礼貌地减少修饰名义后混浊物的累积，淡漠在样品行将使用前进行此处理。这种实时性对于保持名义修饰效果至关遑急。

石墨烯因其超卓的机械强度、极薄的厚度及优异的导电性，已成为冷冻电镜样品制备的理思援手材料。但是，未经处理的石墨烯名义疏水性强，不利于样品的均匀散布。氢等离子体处理是提升石墨烯亲水性的灵验有缠绵，其精照实施对样品性量具有决定性影响。

氢等离子体处理通过将氢原子引入石墨烯名义，形成部分氢化石墨烯，从而改造其名义特色。抵制氢离子能量至关遑急，过高的能量(>21电子伏)可能导致碳晶格结构毁伤，而非预期的化学修饰。此外，处理时辰的精准抵制雷同遑急，以达到相宜的亲水性同期保持石墨烯的完整性。

有缠绵8：石墨烯载网的氢等离子体处理

1高纯度气源与确立要求：必须使用超高纯度氢气(纯度>99.999%)、全不锈钢管说念及配件(严禁使用塑料部件)以及超高纯度品级革新器，确保处理过程不引入混浊物。

2等离子体参数优化：线圈至样品的距离需精准抵制，径直影响氢离子能量。理思情况下，应确保样品处氢离子能量低于21电子伏溅射阈值，可通过朗缪尔探针测量等离子体能量与距离的关系。或者，可通过对比处理前后石墨烯载网的完整性来考据能量参数是否合适。

3等离子体腔预处理：在矜重处理前，应将等离子体腔抽真空至远低于10^-4托，4并使用100%纯氢(35瓦正向功率，<2瓦反向功率，20 SCCM气体流量)在空载网中进行10分钟的预松手，仅在装载前排气。

5石墨烯载网处理：将石墨烯载网安装在样品杆上，装入等离子体腔并抽真空至远低于10^-4托。使用研究诞生，进行5-40秒(时常20秒)的氢等离子体处理。处理完成后应立即取出并使用，以确保名义特色不发生变化。

5 样品玻璃化时期

玻璃化时期行为冷冻电镜样品制备的关节有缠绵，领先由Jacques Dubochet过火共事于20世纪80年代开导。该时期的中枢在于通过快速冷却，使卵白质溶液中的水保持非晶态、非结晶状况，从而形成玻璃态冰。

顺利制备玻璃态冰需知足特定条款：样品必须在极短时辰内（不到10^-4秒）履历约200K的温度诽谤，冷却速率必须越过10^5-10^6 K/s（Dubochet，1988）。由于水的导热性能较差，样品厚度必须抵制在3μm以下以确保均匀快速冷却。

面前市集上存在多种手动及半自动化冷冻浸渍安装，包括FEI、Leica、EMS和Gatan等公司提供的买卖确立，这些确立简略提供可控的温度与湿度环境，灵验驻扎样品挥发，提升制备过程的可重迭性。

值得隆重的是，在样品处理过程中，即使极微量的水分挥发（相等于几百层水分子单层）也可能导致悬唐突层中盐浓度升高，pH值变化幅度可达两倍或更多。举例，在4°C和90%相对湿度条款下，挥发速率约为10nm/秒，这意味着在吸赞好意思冷冻之间的2秒内，一个40nm厚的薄膜可能被浓缩至本来的一半，引起权贵的浸透压和卵白质构象变化。

因此，淡漠在样品载网周围保管100%相对湿度，驻扎冷冻前溶质浓度发生不利变化。在4°C环境下操作尤为理思，因为此温度下达到饱和所需水蒸气量较少，更容易将露点提升至环境温度，从而灵验驻扎挥发。

样品加载至载网后，应马上完成后续门径，以最大礼貌减少卵白质与潜在蹂躏性气水界面的斗争时辰。

对于玻璃化规范的详备征询可参阅Dobro、Melanson、Jensen和McDowall（2010）的综述著作。以下使用Vitrobot（FEI）的规范适用于全金和尺度Quantifoil载网。

有缠绵9：尺度玻璃化规范

环境准备：用18 MΩ去离子水填充冷冻浸渍器水箱，均衡至4°C和100%相对湿度。确保环境湿度恒久保持在100%，迥殊是在4°C条款下操作，可最大礼貌减少样品挥发。

器具检查与清洁：确保使用的镊子敏锐、对称对皆，并经过酒精澈底清洁。用高纯度洗涤剂(2% Micro-90)清洁乙烷杯、载网盒架和泡沫杜瓦瓶，随后用超纯水澈底冲洗并干燥。

冷冻介质准备：在冷冻浸渍器充分均衡后(至少20分钟)，使用液氮冷却浸渍杜瓦瓶，然后用乙烷填充中央杯。隆重：液态乙烷具有潜在危境性，操作时必须提醒安全眼镜。确保乙烷温度刚好高于其熔点90K。

载网准备：通过上述氢等离子体处理使载网亲水。仅使用干净、平整、完整的载网，障碍的载网在冷冻浸渍过程中会进一步损坏。

样品加载与吸水：将载网安装在清洁的冷冻浸渍器镊子上，在箔面上精准施加3微升卵白质溶液(时常浓度为10-5000 nM)，隆重不要让吸管顶端斗争载网名义。使用预设的吸水参数进行操作，保举不使用"恭候时辰"或"排水时辰"，以加速过程并最小化样品与气-水界面的斗争时辰。

图10 载网的玻璃化和安装。（A）障碍的载网在低温冷冻过程中会受损，导致箔片离散。B面板展示了一个离散的金箔示例（比例尺2μm）。载网还需要正确安装在显微镜卡盒中。C面板炫耀了在Krios卡盒中安装不正确且因此受损的载网。D面板中的载网安装正确。C和D面板中的比例尺为500μm。

快速冷冻：将样品浸入液态乙烷中，恭候约一分钟让镊子充分冷却。随后通过液氮上方的冷蒸汽防御性将冷冻样品转机到存储盒中，开释镊子合手力时轻轻让固化的乙烷从载网上剥落。将载网存放在带盖、象征的载网盒中，置于液氮存储杜瓦瓶中历久保存。

隆重事项：全程幸免载网与任何物体斗争碰撞。任何被碰撞或障碍的载网都应丢弃。时常，通过调治等离子体清晰时辰和吸水力度来优化冰层厚度。对于亲水性不足的载网，时常会不雅察到载网方孔中心的冰层较着增厚，这是由于疏水名义扼杀液体所致。

高分辨率数据汇集

与大多数科学仪器一样，电镜过火探伤系统的性能与罢了此性能所需的资源插手之间存在较着量度。鉴于结构生物学商酌的根柢方针是获取实足高分辨率的生物结构以明确解答科常识题，咱们需要在仪器性能与数据质料、数目之间寻求最好均衡点（图1）。

基于现存时期，咱们合计将更多元气心灵插手于样品制备优化是最具效益的政策，因为不管面前或将来，样品性量仍将是决定分辨率和密度图可说明性的关节因素。

生物样品电子显微成像主要受限于电子束导致的样品毁伤。因此，电子探伤器的量子效劳成为影响成像质料的最遑急单一因素。基于当今对探伤量子效劳(DQE)的相识及各式买卖探伤器的测量数据，咱们在表1中回来了当代探伤器的关节参数及保举电子通量。这些参数投合照明条款和样品迁徙抵制因素，组成了表2中保举成像条款的基础。这些淡漠可行为商酌东说念主员在数据量、分辨率和仪器时辰等因素间进行弃取的起初，并将随时期高出束缚更新。

表2 MRC LMB面前保举的数据汇集诞生

ᵃDQE在约80 keV时对于磷光体耦合CCD最大，但在120 keV时样品充电效应和平均解放程较低。

ᵇ像素大小受通量限制而非空间分辨率限制。

咱们在此提供一套应用于配备Falcon 2探伤器的Titan Krios电镜的高分辨率数据汇集尺度历程。基于表1和表2中的参数诞生，此有缠绵可纯真调治以顺应不雷同品类型及显微镜设立，确保最好成像效果。

有缠绵10：使用Krios/Falcon 2和全金相沿进行高分辨率数据汇集

1样品装载：将样品和校准载网(PtIr、石墨化碳或近似物)装入卡盒并安装在自动加载器中。丢弃总共在处理过程中障碍或蹂躏的样品。

2样品检查：将样品装入柱中，使用低倍率检查载网完整性和冰层厚度。可通过增多几百微米的离焦来提升下倍率下的对比度，以更准确判断冰层厚度。

3电镜系统校准：在遴选样品后，加载校准载网并在低剂量曝光神态下实行全面的电镜瞄准，包括电子枪瞄准、聚光器和物镜光阑瞄准、电子束歪斜、相机增益翻新以及聚光器和物镜像差翻新。

4数据汇集区域聘任：再行加载所选样品，使用低倍率和高离焦找到总共适当数据汇集的方孔。淡漠使用自动化软件在低倍率下创建图像拼接(图集)辅助聘任。总共用于数据汇集的方孔应无轻佻、结晶冰和混浊。

5参数考据与优化：汇集几个测试显微相片，阐明冰相、厚度和颗粒散布。在曝光神态下通过电子束歪斜或不雅察孔边际的条纹/亮点来精准诞生焦距。检查曝光神态下电子束的照明几何风物，确保电子束呈圆形、以成像轴为中心、以孔为中心，同期包围孔周围相沿的环形区域。

6 数据汇集：出手矜重数据汇集，可手动操作或使用自动数据汇集软件。淡漠每汇集20-30个孔检查一次焦点和照明状况。如系统安装正确，80μm方孔内的焦点变化应小于1-2μm。为考据数据质料，淡漠汇集总显微相片的1-2%行为歪斜对照组，时常使用[0,15°]的歪斜角度和[1,3秒]的曝光时辰。

采取径直电子探伤器网罗的每组数据均需进行严格锻真金不怕火，以确保样品制备和照明条款已达到最优，从而将颗粒畅通降至最低。现阶段，最为灵验的锻真金不怕火有缠绵是对每张显微相片应用畅通翻新规范，如motioncorr。

在尺度操作历程中，每张显微相片以电影神态汇集，总发射剂量被分割为多个寂寥帧。畅通翻新算法简略精准识别样品随时辰的举座位移。该规范运算高效，使商酌东说念主员简略在成像过程中实时评估样品相沿的结实性。

本商酌在Titan Krios电子显微镜上搭配Falcon 2径直电子探伤器（像素尺寸为1.7Å）进行实验，曝光时辰为1秒，电子剂量为16 e/Ų。商酌末端（图11）炫耀，在研究保举对称条款下汇集的两组数据呈现权贵相反：全金相沿上的畅通小于1.5Å，不足一个像素；而尺度Quantifoil相沿上的畅通大小则高出一个数目级。

图11 在数据网罗时期或之后检测样品迁徙。在数据汇集过程中，不错使用实时快速傅里叶变换（FFTs）检测无数的样品迁徙或载物台漂移。图中炫耀了莫得载物台漂移（A）和以10 Å/秒温度引起的载物台漂移（B）的样品FFTs。显微相片C炫耀了保举的对称照明，照耀吊挂在全金相沿膜孔上的冷冻样品。直方图炫耀了在C中所示的研究对称照明条款下，全金相沿与金上无定形碳（Quantifoil）上1秒显微相片（16 e⁻/Ų）的平面迁徙统计。插图为直方图原点隔壁的放大图。

鉴于当代超结实相沿与低漂移电镜载物台的组合使用，样品相沿的举座位移理当聊胜于无。因此，显微相片畅通追踪算法不仅可用于惯例检测，还可行为会诊器具，匡助商酌东说念主员识别数据汇集诞生失误、载物台漂移或载网损坏等问题，从而确保获取最高质料的电镜数据。

参考贵府

L.A. Passmore, C.J. Russo, Specimen Preparation for High-Resolution Cryo-EM, Methods in Enzymology,2016

起首于老千和他的一又友们，作家孙千

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